角膜交联术新进展与临床运用

 【摘要】  紫外光核黄素角膜交联术(corneal collagen crosslinking,CCL)是一种二十一世纪初应用于临床的最新的角膜成形技术。以核黄素作为光敏剂应用370nm紫外线对角膜进行局部照射，刺激胶原纤维交联，增加角膜硬度。该技术已经在临床崭露头角，有望成为人们比较熟悉的角膜成型技术如传导性角膜成形术和角膜基质环植入术的辅助治疗手段。这些被称为角膜成形学的治疗或手术技术，可望开辟一个新的领域，治疗以往无法治疗的某些角膜疾病。利用CCL，眼科医生可重塑角膜结构，而不需使用如穿透性角膜移植术或板层角膜移植术等创伤性技术。用这种方法代替角膜基质环植入术，或与之相结合，可显著提高圆锥角膜的治疗效果。经过几年的苦心研究，CCL的技术方法得到了改进，治疗范围也有所扩大。不仅用来治疗进展性圆锥角膜，同时也为难治性角膜溃疡、角膜变性、术后角膜扩张病等角膜疾病的治疗带来希望。

【关键词】  角膜交联术;进展性圆锥角膜;难治性角膜溃疡;术后角膜扩张病;耐酶性

　Recent advancement and clinical application of corneal collagen crosslinking

　　Jing Li,Li Jiang, ZhengWei Shen

　　Department of Ophthalmology，General Hospital of Wuhan, Guangzhou Military District, Wuhan 430070, Hubei Province, China

　　Correspondence to: ZhengWei Shen. Department of Ophthalmology, General Hospital of Wuhan, Guangzhou Military District, Wuhan 430070, Hubei Province, China. zhwshen@21cn.com

　　Received:20100607 Accepted:20100806

　　Abstract

　　Corneal collagen crosslinking( CCL) is the latest corneal shape technology in clinical application in 21 century. Riboflavin, a photosensitizer,can be applied to local irradiation of the cornea by 370nm ultraviolet and it can stimulate collagen crosslinking,and increase corneal rigidity. The technology is expected to become more familiar with the corneal molding techniques such as conductive keratoplasty and corneal ring implantation for secondary treatment in clinic. These corneal molding surgeries are expected to open up a new field, and treated with new corneal disease. Ophthalmologists can reshape the corneal structure without penetrating keratoplasty or lamellar keratoplasty and other invasive techniques by CCL. Instead of corneal ring implantation, it can improve significantly treatment effect of keratoconus. Technical methods with CCL has been improved, and the treatment range has also increased. Besides progressive keratoconus, the refractory corneal ulcer, corneal degeneration, corneal expansion diseases were all applied.

　　KEYWORDS: corneal collagen crosslinking; progressive keratoconus; refractory corneal ulcer; corneal expansion diseases; resistance to enzymatic

　　Li J,Jiang L,Shen ZW.Recent advancement and clinical application of corneal collagen crosslinking. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) 2010;10(9):17131715

　交联是一个使工业材料通过聚合变坚固的常用方法，并在生物工程中起稳定组织的作用[1]。例如，化学交联如戊二醛用于制备对人工心脏瓣膜，物理交联如紫外线通常用于牙科充填材料的固化[2]，病理科组织标本的保存和硬化也需要化学交联戊二醛或甲醛;在角膜老化过程中出现胶原纤维变粗和变质硬的现象，被证明是与随年龄增大而出现的胶原分子糖基化有关;另外一个有意义的临床现象是：年轻的糖尿病患者从来不会发生圆锥角膜，即使在少数情况下，圆锥角膜出现在糖尿病发病之前，也会因为糖尿病的出现而使圆锥角膜的病情不再进展，这正是由于糖尿病引起角膜基质内的自发糖基化反应，增强了角膜的强度。受这些现象启发，自20世纪90年代开始，研究人员开始试图利用光或热处理角膜，通过羟基自由基介导的氧化反应以增强基质胶原纤维的强度。德国的一个研究小组最早在20世纪末开始研究如何采用保守治疗来阻止圆锥角膜的病情进展，而避免采用传统的手术疗法，解决临床上角膜供体材料紧张的难题。

　　1原理

　　1.1 CCL基本原理

　　CCL基本原理是光敏剂核黄素(即维生素B2)在370 nm波长紫外光作用下，被激发到三线态，产生以单线态氧为主的活性氧族。活性氧族可以与各种分子发生反应，诱导胶原纤维的氨基(团)之间发生化学交联反应(Ⅱ型光化学反应)，从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力[3]。波长度370nm被用于CCL，是因为核黄素在此波长有一个吸收峰[4]。角膜的生物力学属性取决于胶原纤维、胶原纤维束和它们的空间结构组成。通过CCL可使角膜的生物力学强度加强。

　　1.2超微结构改变

　　角膜基质层(占角膜厚度90%)共包含有200～250个胶原纤维板层，板层之间重在一起，各层之间充满黏多糖。人类角膜中的胶原主要是Ⅰ型胶原和Ⅵ型胶原，其他还有Ⅲ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅷ型胶原。Ⅰ型胶原为粗横纤维，呈网状排列，构成基质的支架，Ⅵ型胶原为丝状结构，在胶原纤维间起连接作用，二者对维持角膜机械张力起主要作用[5]。Wollensak等[6] 对紫外光核黄素引起角膜硬度增加的机制进行了研究。对新西兰大白兔进行CCL治疗4h后处死，取角膜制作超薄切片，在电镜下观察角膜胶原纤维直径,发现经过治疗后同1眼，前部(50μm深度)基质胶原纤维直径比后部(350μm深度)基质增加9.3%。前部角膜基质的胶原纤维直径比未处理的对侧眼增加12.2%，后部角膜基质的胶原纤维直径比未处理的对侧眼增加4.6%。这一超微结构的改变正是CCL疗法提高角膜机械强度的解剖学基础，而胶原纤维直径增粗在前部基质更为显著，与紫外光通过基质时迅速衰减和核黄素吸收紫外光主要在前部基质有关。

　　1.3耐酶性

　　角膜内含有各种酶，例如磷酸脂酶、淀粉酶、三磷酸腺苷酶、胆碱酯酶、胶原酶等，这些酶在上皮和内皮细胞内含量较基质多[5]。特别是已经发生角膜溃疡的角膜，不管是感染菌属产生的酶还是自身免疫反应作用，其含酶量及种类也增加。研究发现，经过紫外光核黄素交联的角膜对抗各种酶消化作用的能力显著加强。Spoerl等[7]研究角膜经过胃蛋白酶、胶原酶和胰蛋白酶作用后，交联后的角膜分别在第13d、第14d和第5d出现溶解，而未经处理的角膜分别在第6d、第6d、第2d出现溶解。提示CCL或许可以应用于角膜溃疡的治疗[2]。

　　2操作方法

　　2.1常用操作

　　首先除去角膜中央直径为9mm区域的上皮，将溶解于200g/L右旋糖苷的1g/L核黄素滴加到角膜表面，每3min 1次，持续30min，在裂隙灯蓝光照射下，确认紫外光照射前核黄素已经进入前房。用波长为370±5nm,辐射度为3mW/cm2的紫外光照射30min，相当于3.4J的总照射能量，光束的直径控制为9mm。在照射过程中，每5min用核黄素、右旋糖苷和表面麻醉剂冲洗1次角膜表面。照射结束后，抗生素眼膏涂眼，并用浸有3g/L氧氟沙星的绷带型接触镜盖眼，直至角膜上皮愈合。此方法主要要点：(1)必须将角膜上皮去掉，以保证核黄素能够扩散进入角膜基质;(2)在紫外光照射前，必须用1g/L核黄素溶液滴加到角膜表面最少30min;(3)紫外光辐射度为3mW/cm2，紫外光必须为单一波长370nm;(4)光束的直径控制为7～9mm;(5)接受交联治疗的角膜厚度必须>400μm，以确保角膜内皮不受损害。

　　2.2改进操作方法

　　最初的研究认为不去上皮将影响核黄素的渗透。然而Pinelli[8]的研究发现，事情恰恰相反。他们使用Fluoroscopy来观察上皮缺失核黄素的吸收情况，并比较角膜交联术去上皮与不去上皮的操作方法与回访调查后发现，去上皮并不是角膜交联术最必须基本的项目之一，是否去上皮对核黄素浸润影响并不大，并且发现去上皮组患者反馈更多的眼部不适，同时两组在随后的视觉功能检查也都相仿(如：夜视力的改进、眩光及光晕的减轻和视觉质量的提高)。其要点为：(1)不去上皮;(2)在15min内每隔5min滴5g/L普托卡因两滴;(3)溶解于右旋糖苷的1g/L 5磷酸盐核黄素;(4)用波长为370±5nm、辐射度为3mW/cm2的紫外光照射30min，相当于3.4J的总照射能量;(5)光束的直径控制为7mm(即角膜中心直径7mm);(6)在照射过程中，每3min用核黄素溶液冲洗1次角膜表面，防止角膜干燥。(7)UVA二极管距角膜1cm[9，10]。不去上皮即可避免角膜感染，haze，上皮愈合时间长等术后并发症，减少术后不适症状。为了使光敏剂更好的吸收，McCall等[11]研究发现紫外光核黄素催化交联反应需要的单线态氧，依赖重水延长其半衰期。实验证明作为核黄素溶解媒体的重水用于CCL，可减少核黄素浓度或增加了角膜的机械强度。Leccisotti教授利用庆大霉素预处理角膜3h，随后用麻醉药奥布卡因滴入角膜，最后加入核黄素溶液行紫外光照射。随访0.5a，平均最佳矫正视力(BCVA)提高0.15(其中无改进有21眼，11眼得到提高，1眼视力下降)，平均屈光度改进1.30D;经角膜内皮镜示：内皮密度在6mo内无任何改变。光敏剂维生素B2化学结构中有两个氧链，它被UVA照射后两个氧离子作用胶原交联，光敏剂维生素C化学结构中有3个氧链，由此结构可推导出它能更好更快的吸收光线产生活性氧族[6]。此外，应用现在的技术(如角膜厚度测量仪)可克服目前对角膜治疗厚度的限制(即治疗角膜原则需>400μm)。这种趋势似乎是必要的。Kymionis等[12]研究两组圆锥角膜，中心角膜厚度分别为440，435μm。一组是进展性圆锥角膜(已用角膜地形图连续观察6mo)，另一组是LASIK术后圆锥角膜，角膜陡峭处厚度都<400μm，除厚度<400μm区域外分别行去上皮CCL治疗。术后5d上皮基本愈合，移去角膜接触镜，术后无并发症。随访9mo后两组的角膜地形图表现比较稳定，同时用共焦显微镜分析表明内皮细胞密度无改变。

　　3角膜交联术的安全性

　　Wollensak等[13]研究了紫外光核黄素交联对角膜基质细胞和内皮细胞的损伤作用，发现兔眼经过交联治疗24h后，在深达300μm的角膜基质出现了细胞凋亡，且细胞凋亡的深度与辐射的强度呈正相关。在整个治疗过程中角膜温度都保持恒定，没有发现热灼伤[14];另一临床研究发现，在交联治疗后最早2wk左右，可以发现在角膜300μm处存在分界线，显示浅层交联区与深层未交联区的界限，这可以作为一个观测交联深度的指标。至今尚未发现紫外光核黄素交联引起内皮细胞的损伤。Raiskup等[15]对术后角膜haze进行了研究。随访发现：术后1a，163只行CCL治疗眼中有91.4%角膜透明，而出现角膜haze与薄角膜(平均420±33.9μm)和高曲率(平均71±13.2D)相关。 用于交联治疗的紫外光能量约3.4J/cm2(3mW/cm2)，远远低于可以引起白内障的能量水平70J/cm2;另外，在交联疗法中使用的是A波紫外光(UVA)，而引起白内障的主要是波长290～320μm的B波紫外光(UVB)。引起视网膜热或光学损伤的波长在400～1400μm，引起损伤的最小辐射强度是4.3mW/cm2，由于大部分紫外光经过角膜后被角膜基质和核黄素吸收，能达到视网膜的辐射能量已经很小，所以实验研究和临床未发现交联疗法对晶状体和视网膜产生损害[2]。

　　4临床应用

　　4.1圆锥角膜

　　紫外线核黄素角膜胶原交联治疗圆锥角膜已在一定范围内应用。2008年RaiskupWolf等[16]对其临床疗效进行了调研分析：对130例241眼平均年龄为30.04±10.46岁的患者进行长期随访，最长随访时间为6a;分别从屈光度、最佳矫正视力(BCVA)、角膜地形图、角膜厚度、眼压进行记录。术前主轴K值62.6±12.7D，平均最大K值为53.7±7.5D，平均散光值6.5±4.4D,平均最佳矫正视力(BCVA)为0.39±0.31logMAR。第1a，BCVA、散光度、K值比术前有改进，有的维持稳定状态。角膜交联术后1a，142眼中有53% BCVA至少提高一行，20%维持稳定。50%散光度平均降低0.93D，36%不变。主轴K值，有62%平均降低了2.86D，17%进入静止期。最大K值有56%平均降低了1.46D，30%维持不变。散光度、主轴K值、最大K值最小也可降下0.50D。第2a，随访66眼，与术前参考值相比较，66眼中有57% BCVA至少提高一行，24%维持稳定。43%散光度平均降低1.20D，42%不变。其中60%主轴K值平均降低了2.21D，19%进入静止期。最大K值有54%平均降低了1.91D，35%维持不变，1a屈光度显著降低2.68D。散光度、主轴K值、最大K值最小也可降下0.50D。第3a,33眼继续观察，与术前参考值相比较，33眼中有58% BCVA至少提高一行，29%维持稳定。54%散光度平均降低1.45D，14%不变。其中78%主轴K值平均降低了4.84D，2%进入静止期。最大K值有58%平均降低了2.57D，9%维持不变。散光度、主轴K值、最大K值最小也可降下0.50D。测量IOP没有统计学意义的改变;平均角膜厚度发生了变化，第1a中央角膜厚度均差为2±12μm，第2a则为21±31μm。有2例仍是进展性圆锥角膜并再次行紫外线核黄素角膜胶原交联。在目前研究观察及早期实验是没有观察到内皮损伤或白内障等并发症。

　　4.2 LASIK术后角膜膨胀与LASIK术前紫外光核黄素交联

　　LASIK术前检查技术越来越成熟，严格筛选出符合手术的患者，及早发现患者早期疾病，避免了许多术后并发症。由于个体差异，LASIK始终对角膜产生影响，其中LASIK术后角膜扩张为其罕见又非常严重的并发症之一。Hafezi等[17]对因近视散光行LASIK术继发医源性角膜扩张的10例患者进行了CCL治疗，随访25mo，对术前术后角膜地形图、角膜最大曲率等进行比较，显示术后角膜膨胀被阻止或稳定，角膜最大曲率降低。可能与角膜生物机械力度增加有关。同样Kohlhaas等[18]对1例行LASIK术4mo后双眼圆锥角膜，行CCL治疗圆锥角膜，经各项检查显示圆锥角膜停止了进展。鉴于LASIK术后有可能角膜膨胀，是否可对较薄角膜厚度或可疑患者先行紫外光核黄素交联以增加角膜生物机械力度呢?Kampik等[19]对猪角膜进行常规去上皮CCL，观察行紫外光核黄素交联眼角膜与未交联者分别行LASIK手术在消融率、角膜瓣厚度和屈光率区别。其结果显示紫外光核黄素交联减少近视LASIK手术后屈光变化。虽然激光消融率不受影响,但是紫外光核黄素交联引起角膜瓣厚度的增加。该研究表明角膜经CCL治疗后在行LASIK手术时，需要调整角膜板层刀和激光参数，也就间接地支持紫外光核黄素交联使角膜生物应力增加的理论。

　　4.3角膜溃疡

　　由于角膜溃疡中各种组织降解酶在病情发展中发挥了重要的作用，如果可以增强角膜组织对抗酶消化作用的能力，无疑可以延缓组织溃疡的发展[2]。受此启发，Moren等[20]对一个由于配戴角膜接触镜引起单眼角膜溃疡的女性进行治疗，实验检查排除单纯疱疹病毒,细菌和棘阿米巴感染，患者最佳矫正视力(BCVA)0.02，开始应用广谱抗生素治疗1mo，角膜继续浸润性溃疡、角膜变薄。考虑患者对常规治疗无效果后，给予患者使用CCL治疗。治疗过程中观察患者的疼痛和坏死物质迅速减少，几天内角膜上皮开始恢复，1mo后上皮完全长好，2mo后溃疡基本恢复，治疗9mo后，BCVA 20/30。这个病例表明CCL对感染性角膜炎的治疗有积极的影响，患者治疗后最终的视觉效果令人满意。尽管这项技术并不成熟，但这可能是一种很有前景的治疗角膜炎的新方法。

　　5前景与展望

　　紫外光核黄素角膜交联疗法的出现，为圆锥角膜、医源性角膜扩张、角膜溃疡等疾病的治疗带来了新的希望。尽管实验和临床研究已经初步证实了该疗法的作用机制和疗效，在减轻患者治疗上的不适亦取得了进一步成效，但是作为一个新的治疗手段，紫外光核黄素角膜交联疗法还不够完善，在此基础上不断会有新的疗法产生，并且远期疗效和安全性尚需进一步研究。另外，最近一项研究 表明紫外光核黄素交联作用可以提高巩膜的机械强度，进行性近视发病的重要原因可能是巩膜的生物力学强度下降和变薄[21]，利用紫外光核黄素交联疗法使巩膜纤维发生交联而增强其强度，阻止或延缓近视的病理进程，但同时此手术中需暴露巩膜，对视网膜有细胞毒性作用影响治疗中辐射范围[22]。 此外，利用CCL使角膜基质发生水合作用(交联程度越高，水肿程度越低)，使交联术治疗大疱性角膜病变等病成为了可能[23]，然而这一切都需要我们做进一步研究，完善手术方法，提高疗效及应用范围。

【参考文献】

 　1 Wollensak G.Crosslinking treatment of progressive keratoconus: new hope. Curr Opin Ophthalmol 2006;17(4):356360

　　2 Wollensak G ,Sporl E. Treatment of keratoconus by collagen crosslinking. Ophthalmologe 2003;100(1):4449

　　3 Spoerl E, Mrochen M, Sliney D, et al. Safety of UVAribofl avin crosslinking of the cornea. Cornea 2007;26(4):385389

　　4潘红卫，陈建苏.紫外光核黄素交联治疗圆锥角膜的研究进展.眼科研究 2008;26(5)：397400

　　5刘祖国.眼表疾病学.北京：人民卫生出版社 2003：5603

　　6 Wollensak G，Wilsch M ，Spoefl E， et al. Collagen fiber diameter in the rabbit cornea after collagen crosslinking by riboflavin/UVA. Cornea 2004;23(5)：503507

　　7 Spoerl E, Wollensak G, Seiler T.Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion. Curr Eye Res 2004;29(1):3540

　　8 Pinelli R. Update on Corneal Crosslinking. J Cataract Refract Surg 2008;24(5):494500

　　9 Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Riboflavin/ultravioletainduced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol 2003;135(5):620627

　　10 Seiler T, Hafezi F. Corneal crosslinkinginduced stromal demarcation line. Cornea 2006;25:10571059

　　11 McCall AS, Kraft S, Edelhauser HF, et al. Mechanisms of corneal tissue crosslinking in response to treatment with topical riboflavin and longwavelength ultraviolet radiation (UVA). Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51(1):129138

　　12 Kymionis GD, Diakonis VF, Coskunseven E,et al. Customized pachymetric guided epithelial debridement for corneal collagen cross linking. BMC Ophthalmol 2009;9:10

　　13 Wollensak G, Spoerl E, Seiler T, et al. Stressstrain measurements of human and porcine corneas after riboflavinultravioletAinduced crosslinking. J Cataract Refract Surg 2003;29(9):17801785

　　14 Mencucci R, Mazzotta C, Rossi F, et al. Ribofl avin and ultraviolet A collagen crosslinking: in vivo thermographic analysis of the corneal surface. J Cataract Refract Surg 2007;33(6):10051008

　　15 Raiskup F, Hoyer A, Spoerl E. Permanent corneal haze after riboflavinUVAinduced crosslinking in keratoconus. J Refract Surg 2009;25(9):S824828

　　16 RaiskupWolf F, Hoyer A, Spoerl E, et al.Collagen crosslinking with riboflavin and ultravioletA light in keratoconus:Longterm results. J Cataract

　　Refract Surg 2008;34(5):796801

　　17 Hafwzi F, Kanelloppulos J,Wiltfang R, et al. Corneal collagen crosslinking with riboflavin and ultraviolet A to treat induced keratectasia after laser in situ keratomileusis. J Cataract Refract Surg 2007;33(12):20352040

　　18 Kohlhaas M, Spoerl E, Speck A, et al. A new treatment of keratectasia after LASIK by using collagen with ribofl avin/UVA light crosslinking. Klin Monatsbl Augenheilkd 2005;222(5):430436

　　19 Kampik D, Ralla B, Keller S, et al. Influence of corneal collagen crosslinking with riboflavin and ultravioleta irradiation on excimer laser surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51(8):39293934

　　20 Moren H, Malmsjo M, Mortensen J, et al. Riboflavin and ultraviolet a collagen crosslinking of the cornea for the treatment of keratitis. Cornea 2010;29:102104

　　21 Awetissow ES. Unterlagen zur entstehungstheorie der myopie. mitteilung die sclera in der pathogenese der progredienten myopie. Klin

　　Monatsbl Augenheilkd 1980;176:777781

　　22 Wollensak G, Iomdina E, Dittert DD, et al. Crosslinking of sclera collagen in the rabbit using riboflavin and UVA. Acta Ophthlmol Scand 2005;83:477482

　　23 Wollensak G,Aurich H,Wirbelauer C. Potential use of riboflavin/UVA crosslinking in bullous keratopathy. Ophthalmic Res 2009;41:114117

来源：国际眼科杂志